絲蟲病診斷標準及處理原則――附錄B
發布時間：2011-08-26 共1頁
血清免疫學檢查（補充件）
B1 間接熒光抗體試驗（IFAT）
B1.1 抗原片
B1.1.1 馬來絲蟲成蟲冰凍切片抗原：用馬來絲蟲感染期幼蟲腹腔感染長爪沙鼠。6個月后，從感染鼠腹腔收集雌性成蟲。用生理鹽水洗滌2次，蒸餾水漂洗1次，包埋于3％～5％甲基纖維素中，用冷凍切片機制成厚4～5μm的切片（每一切片含4～6個蟲體橫斷面），貼附于潔凈的載玻片上，用丙酮固定，干燥保存于-20℃備用。
B1.1.2 馬來微絲蚴斷片抗原：從感染馬來絲蟲的長爪沙鼠腹腔液中收集馬來微絲蚴，用PBS（或生理鹽水）洗凈。其懸液置冰格過夜，次日離心濃集，以甲醇固定，然后進行反復超聲斷碎，超聲粉碎機輸出功率不小于25W（每次30s，間隔30～60s，共3～5min），至微絲蚴斷片為長20～30μm.滴1滴微絲蚴斷片懸液（≥100斷片/滴）在潔凈的載玻片上，經50℃左右熱烘固定3min后使用。
B1.2 血樣：血清或濾紙血。
B1.2.1 血清：采集受檢者的靜脈血或末梢血，離心后收集血清。在低溫下運送，4℃保存，-20℃可保存2年左右。其間不宜反復凍融，以免影響抗體效價。
B1.2.2 濾紙干血滴：用定量新華濾紙從受檢者的耳垂或指尖取血，使血滴直徑為1.2cm，血量約20μL（約相當血清10μL），編號、晾干后放入有干燥劑的塑料袋內低溫保存。4℃可保存半年，-20℃可保存2年。
B1.3 操作方法：受檢血清用pH8.0、0.01mol/L PBS稀釋成1∶10或1∶20（每一濾紙干血滴在0.1或0.2mL的PBS液中浸泡30min）。從冰箱取出抗原片，待復溫后，在每一切片或一滴抗原上加1滴稀釋待檢血清，置37℃濕育30min.用PBS洗3次（每次5min）后冷風吹干，滴加用PBS稀釋的羊抗人IgG熒光抗體，同上濕育，洗滌，以0.01％伊文思藍作背景染色2min，同上洗滌，吹干。再加緩沖甘油（pH8.0）后覆以蓋玻片在熒光顯微鏡下檢查。對陽性反應的血樣需連續作倍比稀釋檢測，直至陰性反應為止。最后呈陽性反應的稀釋度即為陽性終點滴度。
B1.4 反應標準
B1.4.1 馬來絲蟲成蟲切片抗原，以蟲體切面的熒光強度及熒光著色范圍區分為4個等級：“－”蟲體切面呈桔紅色，無明顯的黃綠色熒光；“＋”一般亮度的黃綠色熒光，顯色范圍較局限；“＋＋”中等亮度的黃綠色熒光，顯色較廣泛；“＋＋＋”明亮的黃綠色熒光，顯色廣泛。一般以1：20血樣滴度時熒光反應強度呈“＋”及其以上者，判為陽性。
B1.4.2 微絲蚴斷片抗原，以微絲蚴斷片的熒光強度及著色范圍區分成4個等級：“－”微絲蚴斷端呈模糊的淡黃綠色或紅色：“＋”斷端呈黃綠色熒光，形似啞鈴，反襯紅色明顯；“＋＋”斷端黃綠色熒光顯著，膜上也有黃綠色熒光；“＋＋＋”斷端和膜均呈明亮的黃綠色熒光。一般以1：10血樣滴度時出現“＋”及其以上的熒光反應，判為陽性。
B2 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）
B2.1 抗原：馬來絲蟲成蟲可溶性抗原，從感染馬來絲蟲長爪沙鼠的腹腔收集馬來絲蟲成蟲。蟲體經生理鹽水洗滌和蒸餾水漂洗后，置丙酮脫脂干燥，然后加0.01％硫柳汞生理鹽水研磨成勻漿，凍融3天（每天2次）后置4℃冷浸3～4天，超聲粉碎后低溫高速（7000r/min）離心30min，上清液即可溶性抗原。用分光光度儀測定235和280nm波長處的光密度值（OD），按式（B1）計算抗原蛋白量：X（mg/mL）＝（OD235－OD280）×0.4…（B1）
B2.2 操作方法
B2.2.1 常規間接ELISA：用pH9.6，0.05mol/L碳酸鹽緩沖液將抗原按適宜的工作濃度（2～5μg/孔）稀釋，包被聚苯乙烯反應板，每孔加0.3mL，4℃過夜。次日傾去抗原液，用pH7.2 PBS/吐溫-20（PBS/T）洗滌3次，每次5min，甩干。受檢血清（或濾紙干血滴）用PB3/T稀釋成1∶200，每孔加0.3mL，每樣本加3孔，置濕盒于37℃濕育2h，同上洗滌，甩干。每孔加入0.3mL PBS/T的辣根過氧化物酶標記羊抗人IgG，同上濕育，洗滌，甩干。然后加底物溶液［鄰苯二胺40mg，檸檬酸－磷酸鹽緩沖液50mL，蒸餾水50mL和30％過氧化氫（H2O2）40μL〕0.3mL同上濕育，最后每孔加2mol/L硫酸（H2SO4）75μL終止反應。將每樣品3孔的液量吸至比色杯（杯徑1cm），在分光光度儀上測量492nm波長處的光密度（OD）值。每板均設陽性參考血清、陰性參考血清和空白對照孔。測得樣品OD值進行校正。
B2.2.2 改良的間接ELISA：按適宜工作濃度用pH9.6的0.05mol/L碳酸鹽緩沖液稀釋抗原，包被40孔聚苯乙烯反應板，每孔加0.1mL，4℃過夜。次日傾去抗原液，用pH7.2 PBS/T洗滌3次，每次5min，甩干。受檢血樣用PBS/T稀釋成1∶200，每孔加0.1mL，每樣本加2孔，置濕盒，37℃濕育30min，同上洗滌，甩干。每孔加0.1mL PBS/T稀釋的辣根過氧化物酶標記羊抗人IgG，同上濕育，洗滌，甩干。然后加底物溶液0.1mL，同上濕育后加2mol/L硫酸（H2SO4）25μL終止反應。用專用酶標檢測儀（以PBS對照孔校正零點后）測定492（或490）nm波長的各孔OD值。每板設陽性參考血清，陰性參考血清和PBS對照。每樣品的OD值以2孔的平均OD值計，再以同板的陽性參考血清OD值作校正。
B2.3 反應標準
測定100份以上健康人的血清，求其OD值和標準差（SD），以OD均值加2SD作為陽性反應閾值（通常為0.4）。當樣品OD值等于或大于該值時即判為陽性。或以樣品OD值（P）和陰性參考血清OD值（N）的比值P/N≥2者為陽性。
B3 溶液的配制
B3.1 pH8.0，0.01mol/L PBS液原液0.2mol/L磷酸鹽緩沖液
a. NaH2PO4·2H2O 15.6g 蒸餾水加至 500mL
b. Na2HPO4·12H2O 35.82g 蒸餾水加至 500mL
取a液5.3mL，b液94.7mL，NaCl 17g加水至2000mL
B3.2 pH8.0緩沖甘油5份甘油（一級）和1份0.01mol/L PBS（pH8.0）混勻后冰箱保存（無氣泡）。
B3.3 pH9.6、0.05mol/L碳酸鹽緩沖液
Na2CO3 15.9g
NaHCO3 2.93g
蒸餾水加至 1000mL
B3.4 pH7.2 PBS/吐溫－20
NaCl 8.0g
KH2PO4 0.2g
Na2HPO4·12H2O 2.9g
KCl 0.2g
吐溫－20 0.5mL
臨用前加蒸餾水至 1000mL
B3.5 pH5.0磷酸鹽－檸檬酸緩沖液底物溶液
0.1mol/L 檸檬酸溶液（21.041g/L） 25.7mL
0.2mol/L Na2HPO4（28.4g/L） 24.3mL
蒸餾水 50mL
鄰苯二胺 40mg
臨用前加30％過氧化氫（H2O2） 40μL|整理
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B1 間接熒光抗體試驗（IFAT）
B1.1 抗原片
B1.1.1 馬來絲蟲成蟲冰凍切片抗原：用馬來絲蟲感染期幼蟲腹腔感染長爪沙鼠。6個月后，從感染鼠腹腔收集雌性成蟲。用生理鹽水洗滌2次，蒸餾水漂洗1次，包埋于3％～5％甲基纖維素中，用冷凍切片機制成厚4～5μm的切片（每一切片含4～6個蟲體橫斷面），貼附于潔凈的載玻片上，用丙酮固定，干燥保存于-20℃備用。
B1.1.2 馬來微絲蚴斷片抗原：從感染馬來絲蟲的長爪沙鼠腹腔液中收集馬來微絲蚴，用PBS（或生理鹽水）洗凈。其懸液置冰格過夜，次日離心濃集，以甲醇固定，然后進行反復超聲斷碎，超聲粉碎機輸出功率不小于25W（每次30s，間隔30～60s，共3～5min），至微絲蚴斷片為長20～30μm.滴1滴微絲蚴斷片懸液（≥100斷片/滴）在潔凈的載玻片上，經50℃左右熱烘固定3min后使用。
B1.2 血樣：血清或濾紙血。
B1.2.1 血清：采集受檢者的靜脈血或末梢血，離心后收集血清。在低溫下運送，4℃保存，-20℃可保存2年左右。其間不宜反復凍融，以免影響抗體效價。
B1.2.2 濾紙干血滴：用定量新華濾紙從受檢者的耳垂或指尖取血，使血滴直徑為1.2cm，血量約20μL（約相當血清10μL），編號、晾干后放入有干燥劑的塑料袋內低溫保存。4℃可保存半年，-20℃可保存2年。
B1.3 操作方法：受檢血清用pH8.0、0.01mol/L PBS稀釋成1∶10或1∶20（每一濾紙干血滴在0.1或0.2mL的PBS液中浸泡30min）。從冰箱取出抗原片，待復溫后，在每一切片或一滴抗原上加1滴稀釋待檢血清，置37℃濕育30min.用PBS洗3次（每次5min）后冷風吹干，滴加用PBS稀釋的羊抗人IgG熒光抗體，同上濕育，洗滌，以0.01％伊文思藍作背景染色2min，同上洗滌，吹干。再加緩沖甘油（pH8.0）后覆以蓋玻片在熒光顯微鏡下檢查。對陽性反應的血樣需連續作倍比稀釋檢測，直至陰性反應為止。最后呈陽性反應的稀釋度即為陽性終點滴度。
B1.4 反應標準
B1.4.1 馬來絲蟲成蟲切片抗原，以蟲體切面的熒光強度及熒光著色范圍區分為4個等級：“－”蟲體切面呈桔紅色，無明顯的黃綠色熒光；“＋”一般亮度的黃綠色熒光，顯色范圍較局限；“＋＋”中等亮度的黃綠色熒光，顯色較廣泛；“＋＋＋”明亮的黃綠色熒光，顯色廣泛。一般以1：20血樣滴度時熒光反應強度呈“＋”及其以上者，判為陽性。
B1.4.2 微絲蚴斷片抗原，以微絲蚴斷片的熒光強度及著色范圍區分成4個等級：“－”微絲蚴斷端呈模糊的淡黃綠色或紅色：“＋”斷端呈黃綠色熒光，形似啞鈴，反襯紅色明顯；“＋＋”斷端黃綠色熒光顯著，膜上也有黃綠色熒光；“＋＋＋”斷端和膜均呈明亮的黃綠色熒光。一般以1：10血樣滴度時出現“＋”及其以上的熒光反應，判為陽性。
B2 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）
B2.1 抗原：馬來絲蟲成蟲可溶性抗原，從感染馬來絲蟲長爪沙鼠的腹腔收集馬來絲蟲成蟲。蟲體經生理鹽水洗滌和蒸餾水漂洗后，置丙酮脫脂干燥，然后加0.01％硫柳汞生理鹽水研磨成勻漿，凍融3天（每天2次）后置4℃冷浸3～4天，超聲粉碎后低溫高速（7000r/min）離心30min，上清液即可溶性抗原。用分光光度儀測定235和280nm波長處的光密度值（OD），按式（B1）計算抗原蛋白量：X（mg/mL）＝（OD235－OD280）×0.4…（B1）
B2.2 操作方法
B2.2.1 常規間接ELISA：用pH9.6，0.05mol/L碳酸鹽緩沖液將抗原按適宜的工作濃度（2～5μg/孔）稀釋，包被聚苯乙烯反應板，每孔加0.3mL，4℃過夜。次日傾去抗原液，用pH7.2 PBS/吐溫-20（PBS/T）洗滌3次，每次5min，甩干。受檢血清（或濾紙干血滴）用PB3/T稀釋成1∶200，每孔加0.3mL，每樣本加3孔，置濕盒于37℃濕育2h，同上洗滌，甩干。每孔加入0.3mL PBS/T的辣根過氧化物酶標記羊抗人IgG，同上濕育，洗滌，甩干。然后加底物溶液［鄰苯二胺40mg，檸檬酸－磷酸鹽緩沖液50mL，蒸餾水50mL和30％過氧化氫（H2O2）40μL〕0.3mL同上濕育，最后每孔加2mol/L硫酸（H2SO4）75μL終止反應。將每樣品3孔的液量吸至比色杯（杯徑1cm），在分光光度儀上測量492nm波長處的光密度（OD）值。每板均設陽性參考血清、陰性參考血清和空白對照孔。測得樣品OD值進行校正。
B2.2.2 改良的間接ELISA：按適宜工作濃度用pH9.6的0.05mol/L碳酸鹽緩沖液稀釋抗原，包被40孔聚苯乙烯反應板，每孔加0.1mL，4℃過夜。次日傾去抗原液，用pH7.2 PBS/T洗滌3次，每次5min，甩干。受檢血樣用PBS/T稀釋成1∶200，每孔加0.1mL，每樣本加2孔，置濕盒，37℃濕育30min，同上洗滌，甩干。每孔加0.1mL PBS/T稀釋的辣根過氧化物酶標記羊抗人IgG，同上濕育，洗滌，甩干。然后加底物溶液0.1mL，同上濕育后加2mol/L硫酸（H2SO4）25μL終止反應。用專用酶標檢測儀（以PBS對照孔校正零點后）測定492（或490）nm波長的各孔OD值。每板設陽性參考血清，陰性參考血清和PBS對照。每樣品的OD值以2孔的平均OD值計，再以同板的陽性參考血清OD值作校正。
B2.3 反應標準
測定100份以上健康人的血清，求其OD值和標準差（SD），以OD均值加2SD作為陽性反應閾值（通常為0.4）。當樣品OD值等于或大于該值時即判為陽性。或以樣品OD值（P）和陰性參考血清OD值（N）的比值P/N≥2者為陽性。
B3 溶液的配制
B3.1 pH8.0，0.01mol/L PBS液原液0.2mol/L磷酸鹽緩沖液
a. NaH2PO4·2H2O 15.6g 蒸餾水加至 500mL
b. Na2HPO4·12H2O 35.82g 蒸餾水加至 500mL
取a液5.3mL，b液94.7mL，NaCl 17g加水至2000mL
B3.2 pH8.0緩沖甘油5份甘油（一級）和1份0.01mol/L PBS（pH8.0）混勻后冰箱保存（無氣泡）。
B3.3 pH9.6、0.05mol/L碳酸鹽緩沖液
Na2CO3 15.9g
NaHCO3 2.93g
蒸餾水加至 1000mL
B3.4 pH7.2 PBS/吐溫－20
NaCl 8.0g
KH2PO4 0.2g
Na2HPO4·12H2O 2.9g
KCl 0.2g
吐溫－20 0.5mL
臨用前加蒸餾水至 1000mL
B3.5 pH5.0磷酸鹽－檸檬酸緩沖液底物溶液
0.1mol/L 檸檬酸溶液（21.041g/L） 25.7mL
0.2mol/L Na2HPO4（28.4g/L） 24.3mL
蒸餾水 50mL
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