膜結合細胞器和內膜系統的研究方法［細胞生物學］
發布時間：2011-10-18 共1頁
膜結合細胞器和內膜系統的研究方法
雖然電子顯微鏡能夠獲得高度清晰的細胞內膜系統的結構，但是不能研究單個膜結合細胞器的結構和功能。離心分離技術、同位素示蹤技術和突變技術是有效的研究內膜系統的方法。
■ 放射自顯影術（autoradiography）
胰腺系統中胰泡細胞具有最發達的內膜系統， 主要功能是合成消化酶類。這些酶類合成之后要從胰腺系統經由導管分泌到小腸中行使功能。這些酶是如何分泌出去的？ Jamws Jamieson 和George Palade使用放射自顯影技術證明了蛋白質分泌起始于內質網，經高爾基體到達細胞外。
■ 差速離心分離與功能分析
● 微粒體（microsomes）分離
雖然放射自顯影技術證明了分泌蛋白合成的起始部位，但不能證明合成分泌蛋白的是何種細胞器。Albert Claude和Christian De Duve發展了細胞組份分離技術，分離到了具有蛋白質合成和分泌功能的結構。這些結構稱為微粒體（圖9-8）。
圖9-8 通過差速離心分離微粒體
用機械勻漿將細胞破碎，各種膜細胞器破碎，并且重新自我融合形成各種球形膜泡，通過較高速度離心除去細胞核、線粒體、過氧化物酶體等細胞器。收集懸浮液再用較低速度離心，然后用電子顯微鏡檢查離心后分開的兩部分結構。發現上層的囊泡表面是光滑的，沉淀下的囊泡表面有核糖體顆粒。
● 微粒體的功能研究
通過差速離心分離的微粒體不僅保留了膜的結構特征，同時還具有活細胞中的生物活性和功能。如來自高爾基體的囊泡具有將蛋白質和脂進行糖基化修飾的作用。用從這些囊泡中分離的特殊蛋白作為抗原制備抗體，然后將制備的抗體與特定的顆粒如金顆粒結合，再通過免疫電鏡技術就能夠對用作抗原的酶進行定位，通過這些研究詳細揭示了高爾基體在復雜的糖裝配中的具體過程。
■ 用突變體研究內膜系統的功能
為了研究編碼與分泌途徑相關蛋白的基因，科學家們篩選了一些突變體，在這些突變體中，內膜結構不正常。如獲得的涉及ER出芽小泡形成基因發生突變酵母突變體的ER就特別大； 若是涉及與高爾基體融合的基因突變，這種酵母突變體中就會積累大量的分泌泡。通過對酵母突變體的研究， 揭示了小泡運輸的過程（圖9-9）。
圖9-9 與分泌相關的不同酵母突變體
野生型是分泌正常的酵母，A、B、C、D、E是五類不同的sec基因（secretory genes）突變，代表了蛋白質分泌的五個過程。A：分泌蛋白不能進入內質網，B： 內質網出芽缺陷，C：分泌小泡不能與高爾基體融合：D：高爾基體不能形成分泌泡；E：分泌泡不能與質膜融合。
目前已經分離和克隆了幾十個與分泌途徑相關的基因，通過序列分析，表明這些基因與哺乳動物分泌基因具有同源性， 推測哺乳動物的細胞分泌過程與酵母相似。
